I bioreattori per bioprocessi affrontano il problema dello scale-up sostituendo le superfici di coltura fisse con supporti ad ampia area, sospesi o disposti all’interno di volumi compatti. Per le cellule animali dipendenti dall’ancoraggio, i sistemi a microcarrier rappresentano la soluzione principale: le cellule aderiscono a microsfere, mentre la miscelazione mantiene tali microsfere sospese nell’intero mezzo di coltura. Ciò crea un elevato rapporto superficie-volume, favorisce la crescita ad alta densità e consente ai bioreattori convenzionali a serbatoio agitato di produrre vaccini, proteine terapeutiche e sostanze biochimiche su scala maggiore.
Il concetto centrale: lo scale-up non si ottiene semplicemente rendendo più grande una beuta. È necessario preservare la superficie di adesione di cui le cellule hanno bisogno, migliorando al contempo la miscelazione, l’apporto di nutrienti, il trasferimento di ossigeno e la rimozione dei prodotti di scarto in un ambiente di reazione controllabile.
Perché la dipendenza dall’ancoraggio complica lo scale-up
Le cellule hanno bisogno di una superficie solida per crescere
Le cellule dipendenti dall’ancoraggio devono aderire a un substrato idoneo, come plastica trattata, vetro, collagene o un altro materiale della matrice extracellulare, prima di poter proliferare.
Nel lavoro di laboratorio, questo requisito è gestibile con fiasche T, roller bottle o contenitori a più vassoi. Su scala produttiva, tuttavia, la superficie necessaria diventa difficile da fornire in modo economicamente e operativamente sostenibile.
I contenitori convenzionali aumentano di scala orizzontalmente
La coltura su superficie tradizionale si espande aggiungendo più contenitori anziché aumentando il volume di un singolo contenitore. Questo approccio richiede molto spazio a pavimento e aumenta il lavoro, la movimentazione, il rischio di contaminazione e la variabilità del processo.
Il limite è rappresentato dal rapporto superficie-volume del contenitore. Un grande volume di liquido non è utile se non contiene una superficie accessibile sufficiente per l’adesione cellulare.
L’inibizione da contatto limita l’espansione della superficie
Molte cellule dipendenti dall’ancoraggio smettono di proliferare quando formano uno strato denso su una superficie. Aumentare il numero di contenitori piani può quindi diventare un modo inefficiente per incrementare la produzione cellulare totale.
Il processo necessita di un modo per fornire una superficie di adesione significativamente maggiore senza moltiplicare il numero di contenitori di coltura individuali.
Come i bioreattori a microcarrier risolvono il problema della superficie
I microcarrier trasformano la crescita su superficie in coltura sospesa
I microcarrier sono piccole microsfere solide o porose che forniscono siti di adesione alle cellule. Sono sospesi in un mezzo liquido all’interno di un serbatoio agitato modificato, di un letto fluidizzato o di un reattore analogo.
Questa configurazione trasforma una coltura dipendente dalla superficie in una coltura su superficie distribuita all’interno di un volume liquido. Il reattore può quindi utilizzare il volume, la miscelazione e la strumentazione delle apparecchiature convenzionali per bioprocessi, mantenendo al contempo l’ambiente di adesione richiesto dalle cellule.
Un’elevata superficie entra in un volume compatto
I microcarrier forniscono un elevato rapporto superficie-volume perché molte piccole microsfere espongono le proprie superfici in tutto il reattore. I sistemi comuni utilizzano materiali come il destrano reticolato con rivestimenti di collagene legati covalentemente o applicati in altro modo.
Le concentrazioni di microcarrier riportate nelle fonti fornite variano da circa 3 a 25 g/L, a seconda del supporto e della progettazione del processo. L’aumento della superficie disponibile del carrier può incrementare il numero di cellule coltivate per volume di reattore, purché nutrienti, ossigeno e miscelazione rimangano adeguati.
La miscelazione del reattore mantiene disponibile la superficie di crescita
L’agitazione distribuisce microcarrier, cellule, nutrienti e ossigeno nell’intera coltura. È possibile selezionare giranti specializzate o la circolazione ad airlift per ottenere una sospensione adeguata limitando al contempo lo shear idrodinamico dannoso.
L’obiettivo non è la massima agitazione, ma una circolazione uniforme con un trasferimento di massa sufficiente e danni minimi a cellule e microsfere.
Come i bioreattori migliorano il controllo del processo
Ossigeno e nutrienti possono essere controllati
I bioreattori consentono il controllo attivo di condizioni chiave quali ossigeno disciolto, pH, temperatura, agitazione e alimentazione di nutrienti. Questi controlli sono più uniformi e misurabili rispetto alle condizioni presenti in grandi gruppi di roller bottle o vassoi.
Poiché le cellule adese sono distribuite sui carrier, il processo deve inoltre garantire che il fluido raggiunga le superfici dei carrier e che ossigeno e nutrienti non diventino limitanti nelle colture dense.
I prodotti di scarto possono essere rimossi
Le colture ad alta densità consumano rapidamente i nutrienti e possono accumulare sottoprodotti tossici come ammonio e lattato. I sistemi in grado di operare in perfusione forniscono continuamente mezzo fresco rimuovendo al contempo il mezzo esausto.
Ciò riduce l’esposizione prolungata ai metaboliti inibitori e può sostenere fasi di coltura più lunghe o più produttive rispetto a un processo batch chiuso.
I prodotti fragili possono essere recuperati prima
Nelle fasi finali delle colture batch, la lisi cellulare può rilasciare proteasi e sialidasi che degradano o modificano il prodotto target. Il funzionamento continuo o semicontinuo può ridurre questa esposizione rimuovendo il mezzo contenente il prodotto mentre le cellule rimangono vitali.
I sistemi di perfusione possono inoltre essere integrati con la cattura del prodotto in tempo reale, consentendo di isolare le proteine fragili subito dopo la loro produzione.
Configurazioni di reattore oltre i microcarrier
Reattori a fibre cave
I sistemi a fibre cave o a capillari artificiali forniscono un’ampia area di adesione sulle superfici esterne dei capillari. Nutrienti e gas si muovono attraverso la struttura delle fibre, mentre le cellule rimangono aderenti alla superficie disponibile.
Questi reattori possono offrire elevati rapporti superficie-volume, ma il loro comportamento di trasporto interno e le operazioni di recupero differiscono da quelli dei sistemi a microcarrier agitati.
Letti fissi e fluidizzati
I reattori a letto fisso e a letto fluidizzato utilizzano supporti per l’immobilizzazione al fine di creare superfici di adesione dense. I letti fissi mantengono il supporto in gran parte fermo, mentre i letti fluidizzati fanno circolare le particelle attraverso il mezzo.
Possono fornire una superficie molto elevata, sebbene la distribuzione del fluido, la perdita di carico, il canalizzarsi del flusso e lo scale-up del comportamento fluidodinamico richiedano un’attenta progettazione.
Fogli avvolti e piastre impilate
I reattori a fogli avvolti e i propagatori a piastre impilate aumentano la superficie disponendo numerose superfici piane ravvicinate. Distanziatori e funzioni integrate di airlift o aerazione aiutano a mantenere il flusso di nutrienti e gas tra le superfici.
Questi sistemi possono essere utili quando cellule o processi non sono adatti ai microcarrier liberamente sospesi, ma conservano una maggiore complessità geometrica associata alla coltura su superficie.
Le roller bottle restano strumenti per la fase di inoculo
Le roller bottle forniscono una superficie rotante e rimangono utili per l’espansione nelle fasi iniziali o per la preparazione dell’inoculo. Il loro rapporto superficie-volume relativamente basso le rende meno adatte come piattaforma produttiva principale per processi su larga scala con cellule aderenti.
Il percorso moderno di scale-up passa comunemente dalle roller bottle o dai vassoi a bioreattori a microcarrier o ad alta superficie.
Cosa deve essere preservato durante lo scale-up
Lo shear idrodinamico deve rimanere entro la tolleranza cellulare
I reattori più grandi modificano il movimento del fluido, il comportamento della girante, la dispersione del gas e la turbolenza locale. Le cellule animali dipendenti dall’ancoraggio sono generalmente sensibili a uno shear eccessivo, mentre i microcarrier possono aggiungere ulteriori effetti di collisione e abrasione.
Lo scale-up richiede quindi di replicare condizioni ingegneristiche rilevanti, come la qualità della sospensione, la potenza immessa, il tempo di miscelazione e le prestazioni di trasferimento del gas, invece di copiare soltanto il volume del contenitore.
L’adesione e la distribuzione cellulare devono rimanere uniformi
Le cellule devono aderire efficacemente al carrier e rimanere distribuite sulla superficie disponibile. Una scarsa adesione, l’aggregazione dei carrier o una sospensione insufficiente possono creare regioni con crescita ridotta e regioni con densità locale eccessiva.
La chimica del carrier, il rivestimento, la concentrazione, la strategia di inoculo e l’agitazione fanno tutti parte della progettazione dello scale-up.
Il processamento cellulare può cambiare con le condizioni di coltura
Variazioni dell’ossigeno disciolto, del glucosio, dell’apporto di nutrienti e delle condizioni idrodinamiche possono influenzare non solo la crescita cellulare, ma anche il processamento delle proteine nel reticolo endoplasmatico e nell’apparato di Golgi.
Per i prodotti ricombinanti, l’obiettivo dello scale-up è quindi sia la quantità cellulare sia la qualità del prodotto, comprese modifiche post-traduzionali appropriate come la glicosilazione.
Comprendere i compromessi
I microcarrier aggiungono complessità al processo
Le colture a microcarrier richiedono il controllo della sospensione delle microsfere, dell’adesione cellulare, della concentrazione dei carrier, dell’agitazione e spesso del trasferimento da un carrier all’altro. Anche il raccolto delle cellule o la separazione delle cellule dai carrier può essere più complesso rispetto al raccolto di una coltura convenzionale in sospensione.
Questi requisiti sono giustificati quando la linea cellulare o il prodotto disponibile richiede l’adesione, ma aumentano la complessità dello sviluppo e della gestione operativa.
L’elevata densità può creare nuove limitazioni
Un elevato rapporto superficie-volume non garantisce automaticamente un’elevata produttività. Le colture dense possono comunque sperimentare limitazioni di ossigeno, nutrienti o accumulo di prodotti di scarto se il trasferimento di massa e la perfusione sono insufficienti.
La capacità del reattore deve quindi essere valutata utilizzando la densità cellulare vitale, la produttività specifica, la qualità del prodotto e la durata della coltura, non soltanto l’area dei carrier.
La qualità del prodotto può diminuire in caso di espressione eccessiva
Livelli di espressione molto elevati possono sovraccaricare i meccanismi intracellulari di processamento. Ciò può provocare un processamento incompleto o modifiche delle caratteristiche del prodotto, inclusa una ridotta sialilazione.
La riprogettazione del mezzo, l’integrazione di precursori, gli inibitori enzimatici, l’ingegneria della linea cellulare per ridurre l’apoptosi e un’alimentazione controllata possono essere necessari insieme allo scale-up del reattore.
Tipi diversi di reattore presentano rischi diversi
I sistemi a microcarrier agitati offrono principi familiari di monitoraggio e scale-up, ma espongono cellule e carrier all’agitazione. I sistemi a fibre cave e a letto fisso possono fornire un’ampia superficie con una minore agitazione del volume, ma possono rendere più difficili la distribuzione del flusso, il monitoraggio e il recupero del prodotto.
La configurazione migliore dipende dalla linea cellulare, dai requisiti di adesione, dalla sensibilità del prodotto, dal metodo di raccolta e dalla scala produttiva richiesta.
Come applicare questi concetti al proprio progetto
La strategia di bioreattore appropriata dipende da ciò che limita la coltura attuale: superficie disponibile, sensibilità cellulare, apporto di nutrienti, stabilità del prodotto o recupero a valle.
- Se l’obiettivo principale è la massima densità cellulare: utilizzare una configurazione a microcarrier, letto fisso, letto fluidizzato o fibre cave che fornisca una superficie di adesione significativamente maggiore per unità di volume del reattore.
- Se l’obiettivo principale è una manipolazione delicata delle cellule: selezionare una miscelazione o circolazione a basso shear e convalidare la qualità della sospensione, le collisioni tra carrier e le condizioni di trasferimento dell’ossigeno.
- Se l’obiettivo principale è la qualità del prodotto: controllare ossigeno disciolto, glucosio, nutrienti e durata della coltura, monitorando al contempo le modifiche post-traduzionali e la produttività specifica.
- Se l’obiettivo principale è la stabilità del prodotto: considerare la perfusione con cattura rapida del prodotto per limitare l’esposizione a metaboliti, proteasi e sialidasi rilasciati durante colture prolungate o nelle fasi finali.
- Se l’obiettivo principale è uno scale-up pratico: utilizzare roller bottle o vassoi per la preparazione dell’inoculo, quindi passare a un bioreattore a microcarrier caratterizzato per l’espansione su scala produttiva.
Combinando supporti di adesione ad ampia superficie con una gestione controllata dei fluidi e il ricambio del mezzo, i bioreattori per bioprocessi rendono tecnicamente e operativamente possibile la produzione su larga scala di cellule animali dipendenti dall’ancoraggio.
Tabella riepilogativa:
| Sfida dello scale-up | Soluzione del bioreattore | Vantaggio principale |
|---|---|---|
| Superficie di adesione limitata | Microcarrier, fibre cave, letti fissi o piastre impilate | Elevata superficie in volumi compatti |
| Limitazioni di nutrienti e ossigeno | Miscelazione, aerazione, ossigeno disciolto e alimentazione controllati | Crescita cellulare più uniforme |
| Accumulo di prodotti di scarto | Perfusione e ricambio del mezzo | Minore esposizione ad ammonio e lattato |
| Sensibilità allo shear | Giranti o sistemi di circolazione a basso shear | Migliore vitalità cellulare e sospensione dei carrier |
| Instabilità del prodotto | Rimozione continua del prodotto e cattura rapida | Minore esposizione a proteasi e sialidasi |
| Variabilità dello scale-up | Monitoraggio di pH, temperatura, agitazione e produttività | Prestazioni di processo più uniformi |
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