Tassi elevati di gorgogliamento del gas possono rallentare la crescita microbica rimuovendo la CO2 disciolta più velocemente di quanto la coltura possa reintegrarla. Durante le prime fasi della fermentazione nell'impianto pilota, una bassa densità cellulare comporta una limitata produzione intracellulare di CO2. Se il gorgogliamento rimuove la CO2 disciolta dal terreno, le reazioni di fissazione eterotrofica della CO2 potrebbero non fornire abbastanza carbonio per reintegrare gli intermedi del ciclo di Krebs (TCA) consumati durante la biosintesi, rendendo la fissazione del carbonio anaplerotica un fattore limitante per la crescita.
L'obiettivo non è semplicemente massimizzare il gorgogliamento. Il gorgogliamento deve garantire un adeguato trasferimento di ossigeno preservando al contempo una quantità sufficiente di CO2 disciolta, o fornendola deliberatamente, per sostenere la fissazione del carbonio e un sano accumulo di biomassa durante lo scale-up.
Perché la disponibilità di CO2 è importante durante la fermentazione iniziale
La bassa densità cellulare crea uno squilibrio nell'apporto di CO2
Al momento dell'inoculazione e durante le prime fasi della fermentazione, la popolazione microbica produce relativamente poca CO2 attraverso la respirazione. Di conseguenza, la coltura presenta un accumulo interno limitato di CO2.
Un flusso di gas elevato può rimuovere la CO2 disciolta dalla fase liquida più velocemente di quanto le cellule la generino. Ciò crea un problema di disponibilità di carbonio anche quando il substrato carbonioso primario è presente in eccesso.
La fissazione eterotrofica reintegra gli intermedi del ciclo di Krebs
I microbi consumano gli intermedi del ciclo di Krebs quando sintetizzano aminoacidi e altri componenti cellulari. La fissazione eterotrofica della CO2 reintegra questi intermedi, un processo noto come anaplerosi.
Enzimi come la fosfoenolpiruvato carbossilasi, la fosfoenolpiruvato carbossichinasi e la piruvato carbossilasi incorporano la CO2 negli intermedi metabolici che aiutano a mantenere il funzionamento del ciclo di Krebs.
La limitazione di CO2 può diventare una limitazione della crescita
Quando la CO2 disciolta è troppo bassa, il tasso di fissazione eterotrofica potrebbe non corrispondere al tasso con cui gli intermedi del ciclo di Krebs vengono sottratti per la biosintesi. Il risultato è una ridotta flessibilità metabolica e una formazione di biomassa più lenta.
In termini pratici, la coltura può mostrare una fase di latenza (lag phase) prolungata o un tasso di crescita inferiore alle aspettative durante l'espansione dell'inoculo.
Come il gorgogliamento eccessivo influisce sul bioreattore
L'equilibrio gas-liquido favorisce la rimozione della CO2
Il gorgogliamento rinnova continuamente l'interfaccia gas-liquido e favorisce il trasferimento di massa. Se il gas in ingresso contiene poca o nessuna CO2, un tasso di flusso elevato aumenta la forza motrice per la rimozione della CO2 disciolta.
L'effetto è particolarmente importante quando la generazione di CO2 da parte della coltura è ancora bassa. Più avanti nella fermentazione, una maggiore densità cellulare e la respirazione possono fornire un maggiore apporto interno di CO2, ma ciò non elimina la necessità di monitorare l'equilibrio.
Il trasferimento di ossigeno e la ritenzione di CO2 sono accoppiati
Aumentare il gorgogliamento spesso migliora il trasferimento di ossigeno e aiuta a mantenere la concentrazione di ossigeno disciolto richiesta. L'ossigeno, tuttavia, ha una bassa solubilità nei mezzi acquosi, quindi un apporto adeguato di ossigeno può richiedere un trasferimento di massa gas-liquido sostanziale.
La sfida operativa è che lo stesso flusso di gas che favorisce il trasferimento di ossigeno può anche rimuovere la CO2. L'ottimizzazione su scala pilota richiede quindi di bilanciare il trasferimento di ossigeno, la ritenzione di CO2 e la domanda metabolica della coltura.
L'effetto è più forte durante lo scale-up e l'avvio
L'avvio e lo scale-up dell'inoculo sono periodi vulnerabili perché la coltura ha una bassa biomassa e una limitata produzione respiratoria di CO2. Una strategia di gorgogliamento copiata direttamente da una fase di produzione ad alta densità potrebbe quindi essere eccessiva per la fase iniziale.
Ciò può rendere la fissazione della CO2 il fattore limitante prima che il trasferimento di ossigeno o la disponibilità di substrato diventino limitanti.
Cosa possono regolare gli operatori
Moderare il tasso di gorgogliamento
Utilizzare il flusso di gas più basso che mantenga le prestazioni di trasferimento di ossigeno richieste e il setpoint di ossigeno disciolto. Ciò riduce l'inutile rimozione di CO2 preservando al contempo le condizioni aerobiche.
Il tasso appropriato dipende dalla geometria del reattore, dall'agitazione, dalla composizione del gas, dalla pressione, dalla viscosità e dalla domanda di ossigeno della coltura. Dovrebbe essere stabilito in base ai dati di processo piuttosto che da una regola fissa applicata su diverse scale.
Utilizzare strategicamente la pressione dello spazio di testa
Aumentare la pressione dello spazio di testa (head-space) può migliorare la solubilità dei gas e alterare il trasferimento di massa gas-liquido. Può aiutare a trattenere i gas disciolti, sebbene l'effetto debba essere valutato insieme ai limiti dell'apparecchiatura e alla tolleranza alla pressione dell'organismo.
La pressione è una variabile di processo, non un sostituto universale per il controllo del flusso di gas.
Considerare l'integrazione controllata di CO2
L'aggiunta di CO2 al gas in ingresso o nello spazio di testa può ripristinare la CO2 disciolta quando il gorgogliamento non può essere ridotto senza compromettere il trasferimento di ossigeno. Questo approccio dovrebbe essere controllato attentamente perché una CO2 eccessiva può alterare il pH e imporre un ulteriore stress metabolico.
L'integrazione di CO2 è più utile quando supportata da misurazioni di pH, gas disciolti, tasso di crescita e comportamento dei gas di scarico.
Separare l'apporto di ossigeno dal flusso di gas non necessario
L'agitazione, l'arricchimento di ossigeno, la composizione del gas e la pressione possono influenzare il trasferimento di ossigeno. Valutare queste variabili insieme può consentire al processo di soddisfare il fabbisogno di ossigeno senza fare affidamento esclusivamente su un tasso di gorgogliamento totale molto elevato.
L'obiettivo è mantenere un kLa e un ossigeno disciolto sufficienti evitando un deficit di CO2 evitabile.
Comprendere i compromessi
Un gorgogliamento inferiore può creare limitazioni di ossigeno
Ridurre il flusso di gas in modo troppo aggressivo può diminuire il trasferimento di ossigeno. A una maggiore densità cellulare, l'aumento della respirazione può quindi causare l'esaurimento dell'ossigeno disciolto e limitazioni diffusionali all'interno di pellet o regioni scarsamente miscelate.
La risposta corretta non è minimizzare il gorgogliamento in modo categorico, ma identificare il punto in cui il trasferimento di ossigeno è adeguato senza un'eccessiva rimozione di CO2.
L'integrazione di CO2 può influenzare il pH
La CO2 disciolta partecipa agli equilibri dei carbonati e può influenzare il pH della coltura. L'aggiunta di CO2 senza un controllo coordinato del pH può quindi creare un'escursione di pH indesiderata.
Qualsiasi strategia di integrazione dovrebbe essere valutata sia per il suo beneficio nella fissazione del carbonio che per i suoi effetti acido-base.
Un flusso di gas elevato non è l'unica causa di crescita lenta
Una fase di latenza prolungata può anche derivare dalla qualità dell'inoculo, dalla temperatura, dal pH, dallo squilibrio del substrato, da una scarsa miscelazione o dalla limitazione di ossigeno. La rimozione di CO2 dovrebbe essere trattata come un'ipotesi di processo verificabile piuttosto che data per scontata come unica spiegazione.
Confrontare la crescita sotto diversi tassi di gorgogliamento o concentrazioni di CO2 in ingresso può aiutare a distinguere la limitazione legata alla CO2 da altri effetti di scale-up.
Le misurazioni globali possono mancare di limitazioni locali
Una misurazione della CO2 disciolta rappresenta il liquido globale e potrebbe non cogliere condizioni transitorie o localizzate spazialmente. Il tempo di miscelazione, la distribuzione del gas, la formazione di pellet e la risposta della sonda possono influenzare ciò che la coltura sperimenta.
Per questo motivo, le tendenze nel tasso di crescita e nella composizione dei gas di scarico dovrebbero essere interpretate insieme ai dati sui gas disciolti e sul pH.
Fare la scelta giusta per il proprio obiettivo
Una strategia di controllo pratica dovrebbe tenere conto della fase di crescita della coltura e della necessità concorrente di trasferimento di ossigeno.
- Se l'obiettivo principale è la rapida espansione dell'inoculo: Utilizzare un tasso di gorgogliamento moderato e validato e preservare una CO2 disciolta sufficiente a sostenere il reintegro anaplerotico del ciclo di Krebs durante la crescita a bassa densità.
- Se l'obiettivo principale è il trasferimento di ossigeno: Ottimizzare l'agitazione, la pressione, la composizione del gas e l'arricchimento di ossigeno prima di fare affidamento esclusivamente su un flusso di gas totale più elevato.
- Se l'obiettivo principale è diagnosticare una fase di latenza prolungata: Confrontare i dati di crescita e metabolici tra diversi tassi di gorgogliamento o integrazione controllata di CO2, monitorando al contempo l'ossigeno disciolto e il pH.
- Se l'obiettivo principale è la robustezza della fase di produzione: Stabilire strategie di gorgogliamento separate per l'avvio e l'alta densità, poiché la generazione di CO2 e la domanda di ossigeno cambiano sostanzialmente durante la fermentazione.
Trattando il gorgogliamento come un equilibrio tra l'apporto di ossigeno e la disponibilità di CO2, i team degli impianti pilota possono ridurre le limitazioni di crescita evitabili durante lo scale-up microbico.
Tabella riassuntiva:
| Fattore | Impatto sulla coltura | Risposta pratica |
|---|---|---|
| Tasso di gorgogliamento elevato | Rimuove la CO2 disciolta, specialmente a bassa densità cellulare | Utilizzare il flusso validato più basso che soddisfi le esigenze di ossigeno |
| Bassa CO2 disciolta | Limita il reintegro anaplerotico degli intermedi del ciclo di Krebs | Monitorare i gas disciolti, il tasso di crescita e i dati dei gas di scarico |
| Gorgogliamento ridotto | Può abbassare il trasferimento di ossigeno e aumentare la limitazione di DO | Ottimizzare agitazione, pressione, composizione del gas o arricchimento di ossigeno |
| Integrazione di CO2 | Ripristina la disponibilità di carbonio ma può influenzare il pH | Controllare la CO2 in ingresso e coordinare con la gestione del pH |
| Scale-up della fermentazione | Le fasi di avvio e produzione hanno diverse richieste di CO2 e O2 | Stabilire strategie di gorgogliamento separate in base alla fase di crescita |
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