La stechiometria delle reazioni chimiche determina le relazioni molari teoriche tra ossigeno, substrati, biomassa, anidride carbonica, acqua e prodotti, mentre i bilanci di massa determinano ciò che effettivamente entra, esce, si accumula e reagisce nel bioreattore. Gli ingegneri convertono le quantità di alimentazione e di prodotto in moli, applicano relazioni di reazione bilanciate o coefficienti di resa determinati sperimentalmente e convertono i risultati in tassi di massa o volumetrici. Ciò fornisce la base per stimare il fabbisogno di ossigeno, l'evoluzione di anidride carbonica, la conversione del substrato, la formazione di biomassa e la resa del prodotto.

La stechiometria definisce le possibili relazioni materiali; i bilanci di massa riconciliano tali relazioni con le misurazioni reali del reattore. Insieme, consentono agli ingegneri di stimare l'assorbimento di ossigeno e la formazione di prodotto, identificare perdite o flussi non misurati e progettare la capacità di aerazione, alimentazione, separazione e raffreddamento.

Perché la stechiometria viene prima

Le reazioni bilanciate stabiliscono le relazioni molari

Per l'ossidazione aerobica completa del glucosio:

[ \mathrm{C_6H_{12}O_6 + 6O_2 \rightarrow 6CO_2 + 6H_2O} ]

Una mole di glucosio richiede sei moli di ossigeno e produce sei moli ciascuna di anidride carbonica e acqua.

Questa equazione rappresenta un limite teorico di ossidazione. Le cellule in crescita generalmente utilizzano il substrato per molteplici scopi, tra cui la sintesi di biomassa, il mantenimento, la generazione di energia e la formazione del prodotto desiderato, quindi l'equazione della combustione completa da sola non è sufficiente per la maggior parte dei calcoli di fermentazione.

Le quantità di massa e molari devono essere collegate

I coefficienti stechiometrici si applicano alle moli, non direttamente ai chilogrammi o ai litri. La conversione di base è:

[ n = \frac{m}{MW} ]

dove (n) è la quantità in moli, (m) è la massa e (MW) è il peso molecolare.

Ad esempio, una mole di glucosio ha una massa di circa 180 g e richiede sei moli di ossigeno, o circa 192 g di ossigeno. Pertanto, il rapporto di massa teorico ossigeno-glucosio per l'ossidazione completa è:

[ \frac{6(32)}{180} \approx 1.07 \ \mathrm{g\ O_2/g\ glucosio} ]

I bioprocessi aerobici reali richiedono solitamente un rapporto diverso perché parte del carbonio del glucosio e del potere riducente sono diretti alla biomassa e ai prodotti invece di essere completamente ossidati ad anidride carbonica.

Come i bilanci di massa descrivono il reattore

Il bilancio generale dei componenti

Per qualsiasi componente in un reattore, il bilancio può essere scritto come:

[ \text{Accumulo} = \text{Entrata} - \text{Uscita} + \text{Generazione} - \text{Consumo} ]

Per un substrato come il glucosio, il consumo per reazione è negativo. Per la biomassa o un prodotto metabolico, la generazione per reazione è positiva.

Allo stato stazionario, l'accumulo è zero:

[ \text{Entrata} - \text{Uscita} + \text{Generazione} - \text{Consumo} = 0 ]

I reattori fed-batch e batch richiedono un termine di accumulo perché le concentrazioni e le quantità totali cambiano nel tempo.

Bilanci di substrato, biomassa e prodotto

Un bilancio semplificato del substrato può essere espresso come:

[ \frac{dS}{dt}

\text{alimentazione substrato}

\text{consumo substrato}

\text{uscita substrato} ]

Un bilancio della biomassa può essere rappresentato come:

[ \frac{dX}{dt}

\text{formazione biomassa}

\text{rimozione biomassa} ]

Analogamente, un bilancio del prodotto tiene conto della formazione, degradazione, rimozione del prodotto ed eventuale prodotto che entra con l'alimentazione.

Questi bilanci consentono agli operatori di distinguere la scomparsa del substrato dalla conversione utile. Un substrato può essere consumato senza produrre il prodotto desiderato perché viene utilizzato per il mantenimento, la generazione di calore, il metabolismo di overflow o sottoprodotti indesiderati.

Determinazione del fabbisogno di ossigeno

Domanda teorica di ossigeno

La stima più semplice dell'ossigeno utilizza una reazione bilanciata e il tasso di consumo del substrato noto. Se il glucosio viene consumato a un tasso molare (r_S), l'ossidazione completa prevede:

[ r_{O_2} = 6r_S ]

Per un tasso di consumo di glucosio basato sulla massa, l'ingegnere converte prima il consumo di glucosio in moli, applica il rapporto molare sei a uno e poi riconverte l'ossigeno in massa o volume.

Questo calcolo è utile per stabilire una domanda teorica e verificare se una stima della fornitura di ossigeno è fisicamente plausibile.

Domanda di ossigeno durante la formazione di biomassa

In una coltura in crescita, il consumo di ossigeno è legato a qualcosa di più della semplice ossidazione del substrato. Le cellule usano l'ossigeno per generare energia e sintetizzare biomassa, mentre parte del substrato viene incorporato nel materiale cellulare.

Una relazione pratica è spesso espressa attraverso una resa biomassa-ossigeno:

[ Y_{X/O_2}

\frac{\text{biomassa formata}}{\text{ossigeno consumato}} ]

Pertanto:

[ \text{consumo di ossigeno}

\frac{\text{tasso di formazione biomassa}}{Y_{X/O_2}} ]

Questa resa deve basarsi su unità coerenti, come grammi di peso secco cellulare per grammo di ossigeno. È un parametro empirico o specifico del processo piuttosto che una costante universale.

Assorbimento di ossigeno e progettazione del trasferimento di gas

La domanda biologica di ossigeno calcolata viene comunemente confrontata con la capacità di trasferimento di ossigeno del reattore. La quantità operativa rilevante è il tasso di assorbimento di ossigeno, o OUR (Oxygen Uptake Rate):

[ OUR = \text{tasso di ossigeno consumato dalla coltura} ]

Il reattore deve trasferire l'ossigeno dalla fase gassosa al liquido a un tasso che soddisfi la domanda della coltura. Se la capacità di trasferimento è insufficiente, l'ossigeno disciolto diminuisce anche quando la quantità totale di ossigeno che entra nel recipiente sembra adeguata.

Le stime stechiometriche supportano quindi il dimensionamento e il controllo di:

Flusso di aria o ossigeno
Capacità dello sparger
Potenza di agitazione
Area di trasferimento di massa gas-liquido
Sistemi di controllo dell'ossigeno disciolto
Capacità dell'impianto di raffreddamento

Il metabolismo aerobico genera anche calore. La relazione tra consumo di ossigeno e rilascio di calore dipende dalla reazione metabolica e dalle condizioni operative, ma la domanda di ossigeno fornisce una base importante per stimare il carico di raffreddamento associato.

Determinazione delle rese del prodotto

Rese substrato-prodotto

La resa substrato-prodotto è comunemente definita come:

[ Y_{P/S}

\frac{\text{prodotto formato}}{\text{substrato consumato}} ]

Le unità possono essere grammi di prodotto per grammo di substrato, moli per mole o un'altra base definita esplicitamente.

Una volta noti il tasso di consumo del substrato e la resa, la formazione del prodotto può essere stimata come:

[ \text{tasso di formazione del prodotto}

Y_{P/S} \times \text{tasso di consumo del substrato} ]

Questo calcolo è valido solo quando la base di resa e il regime operativo sono coerenti.

Rese di biomassa

La resa di biomassa è definita in modo simile come:

[ Y_{X/S}

\frac{\text{biomassa formata}}{\text{substrato consumato}} ]

Una (Y_{X/S}) osservata bassa può indicare che più substrato viene ossidato per il mantenimento o deviato verso sottoprodotti. Una resa apparente elevata può riflettere incertezza di misurazione, componenti di alimentazione non contabilizzati o cambiamenti nella composizione della biomassa.

Conversione del carbonio e recupero del prodotto

I bilanci del carbonio sono particolarmente utili per verificare se le rese misurate sono credibili. Il carbonio del substrato deve essere distribuito tra biomassa, prodotti desiderati, anidride carbonica, substrato residuo e altri composti contenenti carbonio.

Un'elevata conversione del substrato non significa necessariamente un'elevata resa del prodotto. Il prodotto desiderato può rappresentare solo una frazione del carbonio consumato, con il resto che appare come biomassa, anidride carbonica, acidi organici o altri metaboliti.

Utilizzo dei bilanci elementari ed elettronici

I bilanci elementari chiudono la reazione biologica

La biomassa non è una singola sostanza chimica pura, ma può essere approssimata usando una formula empirica come:

[ \mathrm{CH_{1.8}O_{0.5}N_{0.2}} ]

La formula esatta dipende dall'organismo, dalle condizioni di crescita e dalla base analitica. Usando formule empiriche, gli ingegneri bilanciano carbonio, idrogeno, ossigeno e azoto tra substrato, biomassa, prodotti, acqua, ammoniaca, ossigeno e anidride carbonica.

Per una conversione biologica generalizzata, i coefficienti stechiometrici vengono selezionati in modo che ogni elemento conservato abbia la stessa quantità totale su entrambi i lati della reazione.

I bilanci elettronici vincolano la domanda di ossigeno

I bilanci elementari tengono conto della conservazione degli atomi. Un bilancio elettronico aggiunge un vincolo sullo stato di ossidazione e riduzione dei composti coinvolti.

Ciò è particolarmente prezioso quando il substrato è distribuito tra:

Prodotti più ossidati come l'anidride carbonica
Prodotti più ridotti come alcoli o acidi organici
Biomassa
Ossidazione generatrice di energia

Combinare bilanci elementari ed elettronici può stimare la domanda di ossigeno e la produzione di anidride carbonica anche quando il percorso metabolico completo non è esplicitamente noto.

Le basi in C-moli semplificano i confronti

I calcoli dei bioprocessi esprimono spesso substrati, biomassa e prodotti su una base di moli di carbonio (C-moli). Ciò rende l'allocazione del carbonio più facile da confrontare tra composti con pesi molecolari diversi.

Una base in C-moli non elimina la necessità di pesi molecolari o composizione elementare. Fornisce un quadro contabile coerente per carbonio, idrogeno, azoto, ossigeno ed equivalenti elettronici.

Applicazione dell'estensione di reazione

Quantificazione della conversione incompleta

L'estensione di reazione, (\xi), rappresenta quanto è progredita una reazione:

[ \xi = \frac{n_i-n_{i,0}}{\nu_i} ]

dove (n_{i,0}) è la quantità iniziale, (n_i) è la quantità finale e (\nu_i) è il coefficiente stechiometrico. I reagenti hanno coefficienti negativi, mentre i prodotti hanno coefficienti positivi.

Una volta determinata (\xi) da una specie misurata, la quantità di ogni altra specie può essere calcolata:

[ n_i = n_{i,0}+\xi\nu_i ]

Questo è utile quando le alimentazioni non sono stechiometriche o le reazioni non procedono fino al completamento.

Collegamento delle misurazioni alle previsioni

Ad esempio, una diminuzione misurata del glucosio può essere utilizzata per stimare il corrispondente consumo teorico di ossigeno e la formazione di anidride carbonica. Le misurazioni effettive dei gas di scarico possono quindi essere confrontate con tali stime per identificare la formazione di biomassa, percorsi alternativi o prodotti non contabilizzati.

L'approccio dell'estensione di reazione è più affidabile quando la rappresentazione della reazione selezionata cattura la conversione biologica dominante e la specie misurata è quantificata accuratamente.

Comprendere i compromessi

Il modello di ossidazione completa non è un modello di fermentazione completo

L'equazione di ossidazione del glucosio è chiara e utile, ma assume un'ossidazione completa. Non tiene conto della sintesi di biomassa, dell'assimilazione dell'azoto, del metabolismo di mantenimento, della formazione di prodotto o dell'ossidazione incompleta.

Usarla come unica base per il dimensionamento dell'ossigeno può sovrastimare o sottostimare la domanda effettiva, a seconda della coltura e del percorso del prodotto.

I coefficienti di resa sono specifici del processo

Valori come (Y_{X/S}), (Y_{P/S}) e (Y_{X/O_2}) dipendono da organismo, substrato, temperatura, pH, ossigeno disciolto, tasso di crescita, requisiti di mantenimento e storia della coltura.

Dovrebbero essere misurati o validati in condizioni operative rappresentative piuttosto che trattati come proprietà fisse dell'organismo.

I bilanci sono limitati dalla qualità della misurazione

La chiusura del bilancio di massa dipende da misurazioni accurate dei tassi di alimentazione, concentrazioni, biomassa, composizione dei gas di scarico, volume del liquido e recupero del prodotto.

Un bilancio che non si chiude può indicare errori di campionamento, evaporazione, accumulo di gas, sottoprodotti non misurati, pesi molecolari errati, variazione della composizione della biomassa o un modello di reazione inappropriato.

La fornitura di ossigeno non è la stessa cosa del trasferimento di ossigeno

Un reattore può ricevere ossigeno sufficiente nel gas in ingresso pur sperimentando una limitazione di ossigeno. Il vincolo decisivo è il tasso al quale l'ossigeno si trasferisce nel liquido e raggiunge le cellule.

Di conseguenza, la domanda stechiometrica di ossigeno deve essere verificata rispetto alle prestazioni di trasferimento del gas, miscelazione, viscosità, pressione e misurazioni dell'ossigeno disciolto.

Come applicare questo al tuo progetto

Usa una base coerente, come chilogrammi all'ora, moli all'ora o C-moli all'ora, e documenta ogni peso molecolare, coefficiente di resa e formula empirica della biomassa.

Se il tuo obiettivo principale è il dimensionamento del sistema di ossigeno: Calcola la domanda di ossigeno basata su substrato e biomassa, quindi verifica che la capacità di trasferimento di ossigeno e il sistema di raffreddamento del reattore possano soddisfare il picco di OUR previsto.
Se il tuo obiettivo principale è la resa del prodotto: Usa i bilanci di substrato, biomassa, prodotto, anidride carbonica e substrato residuo per distinguere la conversione dalla formazione del prodotto desiderato.
Se il tuo obiettivo principale è il controllo dell'impianto pilota: Combina misurazioni di alimentazione, ossigeno disciolto, analisi dei gas di scarico e dati sulla biomassa in bilanci di massa dinamici per stimare i tassi durante l'operazione batch o fed-batch.
Se il tuo obiettivo principale è lo scale-up: Valida le rese stechiometriche e i bilanci elementari a scala pilota, quindi confronta i limiti di trasferimento di ossigeno, rimozione del calore e miscelazione prima di selezionare le condizioni operative su scala industriale.

Una progettazione affidabile del bioprocesso utilizza la stechiometria per definire le relazioni materiali e i bilanci di massa per dimostrare se il reattore reale si comporta di conseguenza.

Tabella riassuntiva:

Focus del calcolo	Relazione chiave	Uso per progettazione o controllo
Domanda teorica di ossigeno	L'ossidazione del glucosio richiede 6 mol O₂ per mol glucosio	Stabilisce un fabbisogno di ossigeno di base
Domanda di ossigeno della biomassa	O₂ consumato = tasso di formazione biomassa / Yₓ/ₒ₂	Stima l'assorbimento biologico di ossigeno
Resa substrato-prodotto	Yₚ/ₛ = prodotto formato / substrato consumato	Prevede la formazione del prodotto e l'efficienza del processo
Resa di biomassa	Yₓ/ₛ = biomassa formata / substrato consumato	Traccia l'allocazione del carbonio alla crescita cellulare
Bilancio del carbonio	Carbonio in ingresso = biomassa + prodotti + CO₂ + residui	Valida la conversione e identifica le perdite
Trasferimento di ossigeno	OTR deve soddisfare OUR	Supporta aerazione, agitazione e controllo dell'ossigeno disciolto
Bilancio di massa dinamico	Accumulo = entrata - uscita + generazione - consumo	Analizza l'operazione batch e fed-batch
Validazione dello scale-up	Confronta OUR, OTR, miscelazione e rimozione del calore	Supporta la progettazione affidabile di reattori pilota e di produzione

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