La morfologia delle cellule microbiche modifica il modo in cui le cellule si muovono, scambiano massa e si separano all'interno delle apparecchiature di bioprocesso. La forma cellulare, le dimensioni, gli strati superficiali e l'aggregazione influenzano il trasporto di nutrienti e ossigeno, la reologia della sospensione, la resistenza idrodinamica, il comportamento durante la centrifugazione, la resistenza alla filtrazione e il fouling delle membrane. Di conseguenza, le apparecchiature progettate attorno a particelle sferiche ideali potrebbero richiedere diverse impostazioni di agitazione, aerazione, pressione, tempo di residenza o forza centrifuga per colture microbiche reali.
La morfologia cellulare è una variabile operativa, non solo una caratteristica biologica. Influisce sulle condizioni idrodinamiche e di trasferimento di massa a cui sono sottoposte le cellule e determina l'efficienza con cui la biomassa può essere recuperata senza eccessivo stress da taglio, fouling o perdita di prodotto.
Perché la morfologia è importante nelle apparecchiature di bioprocesso
La forma modifica l'interazione con il fluido
Cocchi, bacilli e spirilli presentano aree proiettate e orientamenti diversi rispetto al fluido circostante. Queste differenze modificano la forza di trascinamento, il comportamento rotazionale, la frequenza di collisione e lo strato limite locale attorno a ciascuna cellula.
Le ipotesi di cellule sferiche sono utili per calcoli semplificati, ma non descrivono completamente i microrganismi allungati, curvi o a spirale. Le cellule non sferiche possono allinearsi con il flusso, ruotare o subire una resistenza dipendente dall'orientamento.
Le dimensioni influenzano la distanza di trasporto
Le dimensioni cellulari influenzano la distanza che nutrienti, ossigeno e prodotti metabolici devono percorrere tra il fluido di massa e la superficie cellulare. Cellule più grandi o allungate possono sviluppare maggiori differenze di concentrazione intracellulare, in particolare quando le reazioni intracellulari consumano rapidamente i substrati.
La limitazione rilevante può verificarsi all'esterno della cellula, attraverso l'involucro cellulare o all'interno della cellula stessa. Le prestazioni dell'apparecchiatura dipendono quindi sia dal trasferimento di massa esterno che dalla richiesta biologica delle specie trasportate.
Gli strati superficiali modificano il comportamento interfacciale
Gli strati mucosi esterni e altri materiali extracellulari alterano l'idratazione superficiale, l'adesione e l'attrito. Possono aumentare le dimensioni effettive di una cellula e modificare il modo in cui interagisce con bolle, membrane, mezzi filtranti e cellule vicine.
Questi strati possono anche promuovere l'aggregazione o depositi simili a biofilm. Di conseguenza, il comportamento apparente della coltura può differire sostanzialmente da quello di particelle isolate e pulite.
Effetti sul trasferimento di massa
Il trasferimento di ossigeno dipende dalla sospensione cellulare
La morfologia microbica influenza il trasferimento di ossigeno indirettamente attraverso le proprietà della sospensione e direttamente attraverso l'interfaccia cellula-fluido. La forma cellulare, il materiale superficiale e l'aggregazione influenzano il modo in cui le cellule circolano attraverso le regioni ricche e povere di ossigeno del recipiente.
L'agitazione e l'aerazione devono fornire un trasferimento gas-liquido sufficiente mantenendo un ambiente di taglio accettabile. I contattori a membrana a fibra cava e gli assorbitori a riempimento strutturato possono fornire un'elevata area interfacciale per il trasferimento di ossigeno con meno schiuma o taglio rispetto ad alcuni sistemi convenzionali di dispersione del gas.
La morfologia modifica lo strato limite
Il trasferimento di massa dal liquido di massa a una cellula avviene attraverso uno strato limite fluido. Lo spessore e la struttura di questo strato dipendono dalla velocità locale, dalla turbolenza, dalla forma della cellula e dal suo orientamento.
Le cellule allungate o a spirale non presentano la stessa geometria dello strato limite delle sfere. Le variazioni di agitazione, viscosità e regime di flusso possono quindi modificare il coefficiente di trasferimento di massa su scala cellulare anche quando la concentrazione di ossigeno di massa rimane costante.
Gli aggregati creano gradienti interni
Le cellule che aderiscono tramite strati mucosi o altre interazioni superficiali possono formare grumi, fiocchi o aggregati più grandi. Le cellule esterne possono ricevere più ossigeno e nutrienti rispetto a quelle situate all'interno dell'aggregato.
Ciò produce gradienti di concentrazione interni e può ridurre la produttività effettiva della biomassa. Crea anche un problema dipendente dalla scala: un aggregato può comportarsi come una grande particella porosa anche se è composto da molte singole cellule microbiche.
La reologia accoppia biologia e apparecchiature
La morfologia e l'aggregazione influenzano la viscosità del brodo, lo sforzo di snervamento e il comportamento di flusso non newtoniano. Un brodo più viscoso o strutturato può ridurre la circolazione, la dispersione del gas e l'efficacia della miscelazione.
Una scarsa circolazione aumenta i gradienti di concentrazione e temperatura. Può anche abbassare il coefficiente volumetrico di trasferimento di ossigeno effettivo, comunemente indicato come kLa, anche quando i tassi di agitazione e aerazione rimangono invariati.
Effetti sulle dinamiche di separazione
La centrifugazione dipende da più della semplice densità cellulare
Le centrifughe separano la biomassa in base all'equilibrio tra forza centrifuga, galleggiabilità e resistenza idrodinamica. Per particelle sferiche ideali in condizioni di basso numero di Reynolds, la sedimentazione viene spesso approssimata con relazioni di tipo Stokes.
Le cellule microbiche reali possono essere allungate, curve, flessibili, aggregate o circondate da muco. I loro coefficienti di resistenza e le dimensioni effettive differiscono quindi da quelli delle sfere, facendo sì che i tassi di sedimentazione si discostino dalle semplici previsioni per particelle sferiche.
L'orientamento influenza la sedimentazione
Una cellula a forma di bastoncino o a spirale può presentare aree trasversali diverse a seconda del suo orientamento nel fluido. La resistenza risultante non è costante nello stesso modo in cui lo è per una sfera.
In una centrifuga, le cellule possono ruotare o allinearsi mentre migrano. Le prestazioni di separazione dipendono quindi dalla distribuzione delle forme e degli orientamenti, non solo dal diametro cellulare medio.
L'aggregazione può migliorare il recupero
Gli aggregati hanno dimensioni effettive maggiori e possono sedimentare più rapidamente delle singole cellule. Ciò può migliorare il recupero della biomassa nella centrifugazione o aumentare la ritenzione durante la microfiltrazione.
Tuttavia, l'aggregazione può anche intrappolare il prodotto solubile, ridurre l'efficienza di lavaggio e creare pellet eterogenei. Un aggregato più grande è più facile da separare meccanicamente ma può essere più difficile da trattare biologicamente o chimicamente in seguito.
La rottura cellulare cambia il problema della separazione
Molti bioprodotti sono intracellulari, quindi la raccolta della biomassa può essere seguita dalla rottura cellulare. La rottura converte le cellule intatte in una miscela di frammenti, membrane, proteine solubili, acidi nucleici e altro materiale con dimensioni e densità molto diverse.
La linea di processo a valle deve quindi combinare la separazione solido-liquido con un'ulteriore purificazione. La centrifugazione e la filtrazione rimuovono i detriti più grandi, mentre le operazioni a membrana e cromatografiche gestiscono i soluti più piccoli e le biomolecole target.
La filtrazione è sensibile alle proprietà superficiali
Durante la microfiltrazione o l'ultrafiltrazione, la morfologia determina come le cellule si avvicinano, si orientano e si accumulano sulla superficie della membrana. Bastoncini, spirilli, aggregati e cellule rivestite di muco possono formare depositi con porosità e resistenze diverse.
Un deposito compatto può ridurre il flusso aumentando la resistenza idraulica. Un deposito deformabile o adesivo può anche promuovere la polarizzazione della concentrazione e il fouling irreversibile.
Il flusso di membrana riflette le resistenze accoppiate
La separazione a membrana è regolata da gradienti di pressione o concentrazione, diffusione dei soluti e resistenza della membrana e della biomassa accumulata. La morfologia influenza lo strato di biomassa, mentre la reologia del brodo influenza il trasporto attraverso tale strato.
Il monitoraggio del flusso, della pressione, della polarizzazione della concentrazione e del comportamento generale di trasferimento di massa è quindi importante durante l'operazione su scala pilota. Le condizioni che funzionano per una sospensione a bassa viscosità potrebbero fallire quando i cambiamenti morfologici causano una maggiore deposizione o un trasporto ostacolato.
Come devono adattarsi i parametri dell'apparecchiatura
L'agitazione deve bilanciare miscelazione e taglio
Un'agitazione più elevata può ridurre lo spessore dello strato limite esterno e migliorare l'apporto di nutrienti e ossigeno. Può anche aumentare lo stress da taglio, distruggere aggregati fragili, danneggiare le cellule o alterare la morfologia che il processo sta cercando di preservare.
L'impostazione appropriata è quindi un compromesso tra la domanda di trasferimento di massa e la sensibilità della cellula o del prodotto. L'input di potenza da solo non è sufficiente per prevedere le prestazioni quando la reologia e la morfologia del brodo variano.
L'aerazione richiede più del semplice flusso di gas
L'aumento del flusso di gas può aumentare la disponibilità di ossigeno, ma può anche aumentare la formazione di schiuma, lo stress legato alle bolle e le variazioni di ritenzione del gas. Il miglior punto operativo dipende dalla domanda di ossigeno, dalla viscosità del brodo, dalle dimensioni delle bolle e dalla capacità del recipiente di disperdere il gas in modo uniforme.
L'ossigenazione a membrana fornisce un'alternativa quando il trasferimento delicato e la bassa generazione di schiuma sono priorità. Le sue prestazioni dipendono comunque dalla resistenza della membrana, dai gradienti di concentrazione e dalle proprietà del fluido di coltura.
La forza centrifuga deve corrispondere al comportamento cellulare
L'aumento della forza centrifuga può migliorare il recupero di cellule che sedimentano lentamente, ma può compattare i pellet, aumentare il consumo energetico o esporre cellule e prodotti sensibili a stress sfavorevoli.
Le apparecchiature pilota dovrebbero essere valutate utilizzando la chiarificazione osservata, il recupero, le proprietà del pellet e la qualità del prodotto, piuttosto che fare affidamento solo sui coefficienti di sedimentazione calcolati.
La filtrazione richiede il controllo del fouling
La pressione, il flusso tangenziale, la struttura dei pori della membrana e il tempo di residenza influenzano le prestazioni di filtrazione. Una pressione maggiore non produce sempre proporzionalmente più permeato perché la biomassa depositata può aumentare la resistenza del panello e la polarizzazione della concentrazione.
Il pretrattamento, la separazione a stadi, il flusso tangenziale controllato o una fase di chiarificazione preliminare possono essere necessari quando le cellule sono allungate, adesive o fortemente aggregate.
Comprendere i compromessi
Un miglior trasferimento di massa può aumentare lo stress cellulare
L'agitazione e l'aerazione intensificate generalmente migliorano la miscelazione di massa e il trasferimento gas-liquido. Le stesse condizioni possono generare un maggiore stress da taglio e modificare la struttura degli aggregati o gli strati superficiali.
Un processo che massimizza il trasferimento di ossigeno può quindi ridurre la vitalità, alterare la morfologia o rilasciare materiale intracellulare indesiderato.
Una separazione più rapida può ridurre il recupero del prodotto
Una forte centrifugazione o una filtrazione aggressiva possono chiarificare rapidamente il brodo. Possono anche compattare i solidi, trattenere il prodotto all'interno di un pellet o di un panello, o promuovere la lisi cellulare.
La separazione dovrebbe essere giudicata dal recupero e dalla qualità complessiva del prodotto, non semplicemente dalla velocità con cui il liquido diventa limpido.
I modelli sferici sono utili ma limitati
Le equazioni per particelle sferiche forniscono un punto di partenza pratico per stimare la sedimentazione e la resistenza. Diventano meno affidabili quando le cellule sono altamente allungate, flessibili, aggregate, rivestite di muco o presenti in una sospensione concentrata.
I dati empirici su scala pilota dovrebbero essere utilizzati per correggere o convalidare i modelli semplificati prima dello scale-up.
La morfologia può cambiare durante il processo
Le condizioni di crescita, la disponibilità di nutrienti, la limitazione di ossigeno, l'agitazione e lo stress da taglio possono alterare le dimensioni cellulari, la forma, l'aggregazione e il materiale extracellulare. Il comportamento di separazione e trasferimento di massa può quindi cambiare nel corso di un lotto.
Progettare attorno a una singola misurazione morfologica può far perdere questi cambiamenti dipendenti dal tempo. Il monitoraggio del processo dovrebbe collegare le osservazioni morfologiche con il trasferimento di ossigeno, la reologia del brodo, il calo del flusso, la chiarificazione e i dati di recupero.
Fare la scelta giusta per il proprio obiettivo
Le decisioni sulle apparecchiature dovrebbero collegare la morfologia osservata alla modalità di guasto effettiva: trasferimento insufficiente, scarsa miscelazione, basso recupero, fouling o danni al prodotto.
- Se il tuo obiettivo principale è la produttività della fermentazione: Regola l'agitazione e l'aerazione per ridurre le limitazioni dello strato limite e della miscelazione di massa, mantenendo lo stress da taglio e la schiuma entro limiti accettabili.
- Se il tuo obiettivo principale è l'apporto di ossigeno: Valuta il trasferimento gas-liquido o basato su membrana utilizzando kLa specifica della coltura, viscosità, aggregazione e domanda di ossigeno piuttosto che il solo flusso di gas.
- Se il tuo obiettivo principale è la raccolta della biomassa: Misura la chiarificazione e il recupero per le forme cellulari, gli aggregati e gli strati superficiali effettivi invece di applicare stime di sedimentazione per particelle sferiche senza convalida.
- Se il tuo obiettivo principale è la separazione a membrana: Caratterizza la polarizzazione della concentrazione, la resistenza del panello, il calo del flusso e il fouling, poiché la morfologia può controllare la struttura dello strato di biomassa depositato.
- Se il tuo obiettivo principale è il recupero di prodotti intracellulari: Pianifica la sequenza dalla raccolta alla rottura cellulare, rimozione dei detriti, trattamento a membrana e cromatografia come un'unica strategia di separazione integrata.
Comprendere la morfologia consente agli ingegneri di selezionare e far funzionare le apparecchiature di unità in base a come si comporta effettivamente la coltura, migliorando l'efficienza di trasferimento, le prestazioni di separazione e il recupero del prodotto.
Tabella riassuntiva:
| Fattore morfologico | Impatto sul trasferimento di massa | Impatto sulla separazione | Considerazione sull'apparecchiatura |
|---|---|---|---|
| Forma e orientamento cellulare | Modifica la resistenza, lo spessore dello strato limite e lo scambio cellula-fluido | Altera la sedimentazione e il comportamento di deposizione sulla membrana | Convalidare le ipotesi sulle particelle sferiche con dati pilota |
| Dimensioni cellulari | Aumenta la distanza di trasporto e i potenziali gradienti interni | Influenza la sedimentazione, la ritenzione e la chiarificazione | Regolare il tempo di residenza, la forza centrifuga o le condizioni della membrana |
| Strati superficiali e muco | Modificano l'adesione, l'idratazione e il trasferimento interfacciale | Aumentano l'aggregazione, la resistenza del panello e il fouling della membrana | Includere il controllo del fouling e la valutazione delle proprietà superficiali |
| Aggregazione e flocculazione | Crea gradienti interni di ossigeno e nutrienti; modifica la reologia del brodo | Può migliorare il recupero ma intrappolare il prodotto e ridurre l'efficienza di lavaggio | Ottimizzare miscelazione, stress da taglio, pretrattamento e chiarificazione |
| Viscosità del brodo e comportamento non newtoniano | Riduce la circolazione, la dispersione del gas e il kLa effettivo | Aumenta la resistenza idraulica e la polarizzazione della concentrazione | Valutare la reologia specifica della coltura durante lo scale-up |
| Rottura cellulare | Rilascia componenti intracellulari e modifica le condizioni di trasporto | Produce detriti che richiedono chiarificazione e purificazione a stadi | Integrare raccolta, rottura, filtrazione e cromatografia |
| Cambiamenti morfologici guidati dal processo | Causa cambiamenti dipendenti dal tempo nella domanda di ossigeno e nella miscelazione | Modifica il calo del flusso, la chiarificazione e il recupero durante un lotto | Monitorare la morfologia insieme a kLa, flusso, reologia e qualità del prodotto |
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