La formazione di corpi di inclusione rende il processo a valle più complesso, ma può semplificare la cattura iniziale del prodotto. Nei sistemi di espressione batterica come E. coli, la produzione di proteine ricombinanti ad alto livello può superare la capacità di ripiegamento dell'ospite, causando l'accumulo della proteina bersaglio sotto forma di corpi di inclusione insolubili. Un impianto pilota deve quindi aggiungere fasi di rottura cellulare, recupero dei corpi di inclusione, solubilizzazione chimica, rifolding controllato e ulteriori operazioni di purificazione e analisi prima che il prodotto diventi utilizzabile.
I corpi di inclusione spostano il processo dal recupero di proteine solubili alla ricostruzione di un prodotto funzionale. Possono rendere efficiente il recupero primario poiché gli aggregati densi sono facilmente separabili, ma la solubilizzazione e il rifolding introducono requisiti importanti in termini di attrezzature, controllo di processo, gestione della resa e test di qualità del prodotto.
Come i corpi di inclusione modificano il processo a valle
Il prodotto diventa intracellulare
I corpi di inclusione vengono trattenuti all'interno delle cellule batteriche invece di essere rilasciati nel terreno di coltura. La linea di processo a valle deve iniziare con la raccolta cellulare e la rottura meccanica per rilasciare il materiale bersaglio.
L'omogeneizzazione ad alta pressione o un altro metodo di lisi robusto è solitamente richiesto su scala pilota. L'operazione deve essere progettata per ottenere una rottura sufficiente senza un riscaldamento eccessivo, che può aumentare l'aggregazione o accelerare la degradazione proteolitica.
La lisi cellulare rilascia ulteriori impurità
La rottura rilascia proteine della cellula ospite, acidi nucleici, frammenti di membrana, proteasi ed endotossine batteriche insieme ai corpi di inclusione. Ciò crea un problema di rimozione delle impurità più impegnativo rispetto al recupero da un surnatante di coltura chiarificato.
Il controllo delle endotossine è particolarmente importante per i prodotti destinati all'uso terapeutico o iniettabile. Il processo a valle deve quindi includere un'appropriata rimozione delle impurità e test analitici validati, invece di fare affidamento solo sulla separazione fisica dei corpi di inclusione.
I corpi di inclusione consentono la separazione primaria
Gli aggregati insolubili sono più densi e meno solubili di gran parte del materiale cellulare solubile. Dopo la lisi, la centrifugazione o la microfiltrazione possono concentrare e separare la frazione dei corpi di inclusione da una parte sostanziale dei contaminanti solubili.
Questo è il principale vantaggio operativo dei corpi di inclusione: l'arricchimento precoce del prodotto può essere relativamente efficace. Tuttavia, la frazione recuperata non è solitamente bioattiva e contiene ancora impurità della cellula ospite adsorbite o associate.
Operazioni unitarie necessarie per il recupero del prodotto
Raccolta cellulare e rottura ad alta pressione
Il processo inizia generalmente con la centrifugazione o un'altra operazione di raccolta cellulare, seguita dalla rottura cellulare ad alta pressione. Le attrezzature su scala pilota devono tenere conto della viscosità dell'alimentazione, del carico di solidi, della produttività, del controllo della temperatura e di passaggi ripetuti ove necessario.
La fase di lisi influisce anche su ogni operazione successiva. Una rottura incompleta riduce il recupero, mentre un eccessivo stress di taglio o calore può aumentare il rilascio di contaminanti e danneggiare la proteina bersaglio.
Isolamento e lavaggio dei corpi di inclusione
Dopo la rottura, si utilizzano la centrifugazione o la microfiltrazione per recuperare il materiale insolubile dei corpi di inclusione. Possono essere aggiunte operazioni di lavaggio per ridurre frammenti di membrana, acidi nucleici, proteine ospiti solubili e altri contaminanti di processo.
Questi passaggi richiedono un attento controllo della gestione dei solidi e della risospensione. Un lavaggio scarsamente controllato può lasciare impurità o ridurre il recupero a causa della perdita di prodotto durante i trasferimenti e le separazioni.
Solubilizzazione chimica
I corpi di inclusione isolati devono essere convertiti in un flusso proteico solubile. Ciò richiede comunemente agenti caotropici come urea o guanidina, insieme a un pH controllato e, ove pertinente, condizioni riducenti per interrompere le interazioni non native e gli aggregati legati da ponti disolfuro.
La solubilizzazione aggiunge la necessità di serbatoi dedicati, stoccaggio di prodotti chimici, capacità di miscelazione e trattamento dei rifiuti. L'operazione deve inoltre prevenire condizioni che causano ulteriori modifiche chimiche o la precipitazione irreversibile della proteina bersaglio.
Rifolding controllato
La solubilizzazione produce una proteina non ripiegata o altamente denaturata, quindi è necessaria un'operazione di rifolding controllato per recuperare la corretta struttura tridimensionale. Il rifolding può comportare diluizione, rimozione graduale del denaturante, scambio di tampone, controllo redox, gestione della temperatura e concentrazione proteica controllata.
Questa è spesso l'operazione più sensibile alla resa nel processo. I reattori di rifolding possono richiedere volumi e tempi di residenza sostanziali, mentre gradienti di concentrazione locale o una miscelazione scarsamente controllata possono promuovere un nuovo aggregato.
Purificazione cromatografica e concentrazione
Dopo il rifolding, la cromatografia è solitamente necessaria per separare il prodotto correttamente ripiegato dalle specie mal ripiegate, dagli aggregati, dalle proteine residue della cellula ospite, dagli acidi nucleici, dalle endotossine e dai prodotti chimici di processo. Lo scambio ionico, l'esclusione dimensionale, l'affinità o altre modalità possono essere selezionate in base al profilo della proteina e delle impurità.
Possono essere necessarie anche operazioni di concentrazione e scambio di tampone per preparare il prodotto alla formulazione o a ulteriori lavorazioni. La linea finale deve essere progettata tenendo conto sia dei requisiti di purezza che della stabilità della proteina durante l'esposizione a interfacce, pressione, variazioni di pH e fasi di concentrazione.
Verifica analitica
Il processo non può definire il successo basandosi esclusivamente sul recupero proteico totale. I test analitici devono confermare identità, purezza, stato di aggregazione, integrità strutturale e attività biologica.
Per una proteina terapeutica, questa valutazione della qualità può includere saggi per proteine della cellula ospite, DNA residuo, endotossine, residui chimici e altre impurità specifiche del prodotto. Il rifolding crea quindi un onere analitico che si aggiunge a quello delle attrezzature e della lavorazione.
Effetti sulla progettazione e sull'operatività dell'impianto pilota
Attrezzature più specializzate
Un processo con proteine solubili può procedere dalla rimozione cellulare o chiarificazione direttamente alla purificazione. Un processo con corpi di inclusione richiede attrezzature aggiuntive per la lisi ad alta pressione, la separazione dei solidi, la gestione dei denaturanti, il rifolding e la gestione dei rifiuti.
L'impianto pilota deve fornire serbatoi, pompe, centrifughe o filtri, capacità di trasferimento termico e contenimento adeguati per flussi di processo chimicamente aggressivi o ad alta concentrazione.
Maggiore domanda di tamponi e prodotti chimici
La solubilizzazione e il rifolding possono consumare quantità significative di urea, guanidina, agenti riducenti, tamponi e fluidi di diluizione. Questi requisiti influiscono sullo stoccaggio delle materie prime, sulla capacità di preparazione delle soluzioni, sull'ingombro dell'impianto e sui carichi di trattamento dei rifiuti.
Il processo deve anche tenere conto della rimozione o diluizione dei denaturanti prima della cromatografia, della formulazione o dell'uso biologico.
Tempi di lavorazione più lunghi
Il rifolding e le relative operazioni di scambio di tampone possono aggiungere un tempo di residenza sostanziale al programma a valle. Una lavorazione più lunga aumenta l'occupazione dei serbatoi e può creare vincoli di programmazione quando più lotti condividono le attrezzature dell'impianto pilota.
Tempi di sosta prolungati aumentano anche la necessità di controllo della temperatura, gestione del carico biologico e studi di stabilità per i flussi intermedi.
Maggiore rischio di recupero complessivo
Sebbene i corpi di inclusione possano fornire un'elevata espressione volumetrica e un utile arricchimento precoce, ogni operazione aggiuntiva crea opportunità di perdita di prodotto. Le perdite possono verificarsi durante la lisi, il lavaggio, la solubilizzazione, il rifolding, la filtrazione, la cromatografia e i trasferimenti.
La metrica economicamente rilevante non è quindi solo il livello di espressione, ma la quantità di prodotto correttamente ripiegato, purificato e attivo recuperato alla fine dell'intero processo.
Comprendere i compromessi
Il vantaggio principale: cattura precoce efficiente
I corpi di inclusione possono semplificare la prima separazione dopo la lisi perché il bersaglio è concentrato in una frazione particolata. Ciò può ridurre l'onere di processare tutto il materiale cellulare solubile attraverso le fasi di purificazione iniziale.
Tale vantaggio è massimo quando i corpi di inclusione sono sufficientemente arricchiti e possono essere lavati senza un'eccessiva perdita di prodotto.
Il costo principale: ricostituzione del prodotto
La proteina generalmente non è nella sua conformazione nativa attiva quando viene recuperata come corpo di inclusione. Il processo deve quindi ricostruire la struttura corretta in condizioni che competono con l'aggregazione e il ripiegamento errato.
Il rifolding è intrinsecamente specifico per la proteina. Una condizione di successo per una proteina ricombinante potrebbe non essere trasferibile direttamente a un'altra.
L'endotossina non può essere trattata come un'impurità minore
La rottura delle cellule batteriche rilascia endotossine lipopolisaccaridiche dall'involucro cellulare. Poiché l'endotossina può rimanere associata alla proteina e ad altri materiali derivati dalle cellule, deve essere affrontata attraverso una progettazione e test di processo deliberati.
Una centrifuga o un lavaggio dei corpi di inclusione da soli non garantiscono una rimozione delle endotossine di grado terapeutico.
Un'elevata espressione non garantisce il successo del processo
Aumentare l'espressione può incrementare la quantità di materiale dei corpi di inclusione, aumentando al contempo il ripiegamento errato, la proteolisi, l'aggregazione e il carico di impurità. Il miglior punto operativo bilancia tasso di espressione, qualità del prodotto, recupero e capacità a valle.
Strategie alternative, come il targeting periplasmico o condizioni che migliorano l'espressione solubile, possono ridurre la complessità a valle quando la biologia della proteina lo consente.
Fare la scelta giusta per il proprio obiettivo
La linea di processo a valle dovrebbe essere selezionata in base ai requisiti del prodotto finale, non semplicemente al massimo livello di espressione batterica.
- Se il tuo obiettivo principale è la massima espressione volumetrica: utilizza il processo con corpi di inclusione quando i guadagni attesi giustificano la lisi ad alta pressione, il recupero dei solidi, la solubilizzazione, il rifolding e l'aumento della capacità di purificazione.
- Se il tuo obiettivo principale è il recupero del prodotto attivo: dai priorità alle condizioni di espressione e rifolding che preservano la struttura corretta e valuta l'espressione solubile o periplasmica quando fattibile.
- Se il tuo obiettivo principale è la scalabilità dell'impianto pilota: dimensiona serbatoi, attrezzature di separazione, sistemi di tamponi e gestione dei rifiuti in base ai requisiti aggiuntivi di solidi, prodotti chimici e tempi di residenza.
- Se il tuo obiettivo principale è la qualità del prodotto terapeutico: integra fin dall'inizio nel processo i controlli per endotossine, impurità della cellula ospite, aggregati e integrità strutturale.
- Se il tuo obiettivo principale è il costo e la pianificazione: confronta il recupero a valle completo e il tempo di ciclo rispetto a strategie alternative di ospite o espressione, invece di confrontare solo il titolo a monte.
I corpi di inclusione non sono solo un risultato dell'espressione; sono una decisione di progettazione del processo che determina come l'impianto pilota deve recuperare, ripiegare, purificare e verificare la proteina ricombinante.
Tabella riassuntiva:
| Area di processo | Impatto dei corpi di inclusione | Requisito dell'impianto pilota |
|---|---|---|
| Recupero cellulare | Il prodotto rimane intracellulare | Raccolta cellulare e rottura ad alta pressione |
| Separazione primaria | Gli aggregati densi consentono un arricchimento precoce | Centrifugazione o microfiltrazione con lavaggio controllato |
| Solubilizzazione | Gli aggregati richiedono denaturanti e chimica controllata | Serbatoi dedicati, gestione chimica e trattamento rifiuti |
| Rifolding | La proteina non ripiegata deve ritrovare la sua struttura attiva | Diluizione controllata, scambio di tampone, redox, temperatura e miscelazione |
| Purificazione | Proteine mal ripiegate, aggregati, endotossine e impurità ospiti devono essere rimossi | Cromatografia, concentrazione e scambio di tampone |
| Controllo qualità | Il solo recupero non conferma la qualità del prodotto | Test per identità, purezza, attività, aggregazione, endotossine, DNA residuo e proteine della cellula ospite |
| Impatto sulla struttura | Più operazioni aumentano tempi, prodotti chimici, esigenze di attrezzature e rischio di perdita di prodotto | Capacità adeguata per solidi, tamponi, tempi di sosta, controllo temperatura e programmazione |
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