Il meccanismo di secrezione determina dove si trova la proteina al momento del raccolto, e tale posizione determina le prime operazioni unitarie a valle. Una proteina secreta extracellulamente può solitamente essere recuperata rimuovendo cellule e detriti tramite centrifugazione o microfiltrazione, seguita da concentrazione e purificazione. Una proteina intracellulare o periplasmatica richiede operazioni aggiuntive come la raccolta delle cellule, la rottura o il rilascio selettivo e la chiarificazione del lisato prima della cromatografia. Pertanto, la secrezione influisce non solo sulla selezione delle apparecchiature, ma anche sulla complessità del processo, sul carico di impurità, sulla resa di recupero e sul rischio di scale-up.
La questione centrale di progettazione è se la proteina target si trovi nel terreno di coltura, nel periplasma o nel citoplasma. Più il prodotto è lontano dalla fase liquida chiarificata, più operazioni di recupero l'impianto pilota deve aggiungere prima che la purificazione possa iniziare.
Perché la posizione di secrezione controlla il processo
La secrezione extracellulare semplifica il recupero primario
Quando un ospite secerne la proteina ricombinante direttamente nel terreno di coltura, il prodotto è già separato dalla maggior parte dei componenti intracellulari. La prima operazione è quindi la chiarificazione cellulare, comunemente effettuata tramite centrifugazione continua a dischi o microfiltrazione a flusso tangenziale.
Il liquido chiarificato può quindi procedere alla concentrazione, al cambio di tampone, alla precipitazione o alla cromatografia. Questo crea una linea di valle relativamente breve e riduce l'esposizione del prodotto a condizioni di lisi drastiche.
La ritenzione intracellulare richiede il rilascio del prodotto
Se la proteina rimane nel citoplasma, le cellule stesse diventano il flusso contenente il prodotto. L'impianto pilota deve prima raccogliere la biomassa e poi rilasciare la proteina tramite rottura cellulare meccanica o chimica.
L'omogeneizzazione ad alta pressione è un approccio comune per le cellule microbiche. Il lisato risultante contiene proteine della cellula ospite, acidi nucleici, frammenti di membrana, endotossine nei sistemi Gram-negativi rilevanti e altri contaminanti, quindi la chiarificazione diventa più impegnativa.
La localizzazione periplasmatica crea un caso intermedio
Nei batteri Gram-negativi come l'E. coli, un peptide segnale può dirigere una proteina attraverso la membrana interna nel periplasma, ma la membrana esterna generalmente impedisce il rilascio diretto nel terreno di coltura. Il prodotto può quindi essere più facile da accedere rispetto a una proteina citoplasmatica, tuttavia non è equivalente alla secrezione extracellulare.
Gli impianti pilota possono utilizzare metodi di rilascio selettivo, come trattamenti osmotici o chimici, quando compatibili con il prodotto e l'ospite. Questi metodi possono ridurre la lisi cellulare completa, ma richiedono comunque una successiva chiarificazione e controllo delle impurità.
Come il meccanismo si mappa sulle operazioni unitarie
Proteine secrete extracellulamente
Per una proteina rilasciata nel terreno, una sequenza di recupero tipica è:
- Chiarificazione cellulare tramite centrifugazione a dischi o microfiltrazione.
- Concentrazione e diafiltrazione tramite ultrafiltrazione.
- Cattura primaria tramite precipitazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità o altro metodo idoneo.
- Rifinitura (polishing) tramite cromatografia, cristallizzazione, essiccazione o operazioni di finitura correlate.
Poiché il target è presente nella fase liquida, l'impianto può spesso utilizzare apparecchiature di chiarificazione chiuse, continue o semi-continue. Le principali preoccupazioni di progettazione diventano la stabilità del prodotto, la viscosità del brodo, il fouling delle membrane e il carico di contaminanti.
Proteine citoplasmatiche
Per i prodotti trattenuti intracellulamente, il processo richiede generalmente:
- Raccolta della biomassa tramite centrifugazione o microfiltrazione.
- Rottura cellulare tramite omogeneizzazione ad alta pressione o altro metodo di lisi.
- Chiarificazione del lisato tramite centrifugazione o filtrazione su profondità e membrana.
- Concentrazione e cambio di tampone tramite ultrafiltrazione.
- Cattura e rifinitura tramite precipitazione e cromatografia.
La fase di lisi modifica le proprietà fisiche dell'alimentazione. I detriti cellulari, gli acidi nucleici e i componenti dell'ospite rilasciati possono aumentare la viscosità e causare un rapido fouling, rendendo la capacità di chiarificazione e la capacità di gestione dei solidi importanti vincoli dell'impianto pilota.
Prodotti in corpi di inclusione
L'espressione ad alto livello in E. coli può sopraffare i sistemi di ripiegamento cellulare e produrre corpi di inclusione insolubili. In questo caso, la biologia della secrezione è aggravata dalla biologia della forma del prodotto: la proteina è trattenuta intracellulamente e non è inizialmente nella sua forma attiva e solubile.
La linea di valle può richiedere rottura cellulare, recupero dei corpi di inclusione, solubilizzazione chimica e ripiegamento controllato prima della purificazione convenzionale. Il ripiegamento diventa un'operazione unitaria distinta che deve controllare variabili come la concentrazione proteica, la rimozione del denaturante, la miscelazione e il tempo di residenza.
Proteine secrete da ospiti eucariotici
Le cellule eucariotiche possono trasportare proteine attraverso vie di secrezione regolate o costitutive e rilasciarle tramite esocitosi. Quando la secrezione è efficiente, la strategia a valle assomiglia a quella per altri prodotti extracellulari: rimuovere le cellule, concentrare il terreno condizionato ed eseguire cattura e rifinitura.
Tuttavia, il terreno di coltura può contenere proteine della cellula ospite, DNA, proteasi e altre impurità legate al processo. La secrezione riduce la necessità di lisi, ma non elimina la necessità di purificazione selettiva o controlli di stabilità del prodotto.
Come la secrezione cambia la progettazione dell'impianto pilota
L'apparecchiatura di chiarificazione diventa la prima scelta importante
Per i prodotti extracellulari, l'impianto pilota dovrebbe essere configurato attorno alla rimozione affidabile delle cellule da un liquido contenente il prodotto. Le centrifughe a dischi sono utili per la separazione continua dei solidi, mentre la microfiltrazione a flusso tangenziale fornisce un'alternativa scalabile basata su membrana.
Per i prodotti intracellulari, la chiarificazione avviene dopo la rottura e deve gestire un carico di solidi e impurità molto più pesante. L'impianto potrebbe aver bisogno di una miscelazione più forte, una maggiore capacità di chiarificazione e una protezione di filtrazione più robusta.
La sequenza di processo determina l'integrazione delle apparecchiature
La secrezione extracellulare consente di collegare chiarificazione, ultrafiltrazione e cromatografia come una linea relativamente diretta. Skid di ultrafiltrazione modulari e colonne cromatografiche a letto impaccato possono quindi essere utilizzati per studiare pressione transmembrana, flusso, risoluzione, resa e prestazioni del ciclo.
Il recupero intracellulare richiede interfacce aggiuntive tra le operazioni unitarie. L'impianto deve trasferire un fango di biomassa a un sistema di rottura, gestire il lisato, rimuovere i detriti e condizionare l'estratto chiarificato prima della cattura.
La qualità del prodotto influisce sulla severità dell'operazione
La rottura meccanica, la precipitazione con solvente, gli agenti caotropici e il pH estremo possono danneggiare le proteine o promuovere l'aggregazione. Un prodotto secreto può evitare alcuni di questi stress, migliorando l'opportunità di preservare la struttura nativa.
Le condizioni operative rilevanti dipendono ancora dalla proteina. Il suo punto isoelettrico, ad esempio, aiuta a determinare l'intervallo di pH per la precipitazione selettiva e la cromatografia a scambio ionico perché la carica proteica cambia con il pH rispetto al suo pI.
Il rischio di scale-up si sposta con la via di recupero
Per i prodotti secreti, i rischi di scale-up si concentrano spesso sulla capacità di chiarificazione, sul fouling delle membrane, sull'adsorbimento del prodotto e sulla concentrazione del prodotto diluito. Per i prodotti intracellulari, i rischi critici includono l'energia di rottura, la generazione di calore, la viscosità, la rimozione dei detriti e il rilascio incoerente.
Gli impianti pilota dovrebbero quindi misurare più della semplice resa di recupero finale. Dovrebbero anche valutare il carico di solidi, il tempo di chiarificazione, la capacità del filtro, il flusso di membrana, la pressione, il tempo di residenza e l'attività del prodotto dopo ogni operazione principale.
Comprendere i compromessi
La secrezione riduce le operazioni ma può ridurre le prestazioni di espressione
La secrezione diretta può accorciare il processo a valle e ridurre la complessità delle impurità. Tuttavia, la secrezione dipende dall'ospite, dalla sequenza segnale, dalla via di trasporto, dall'ambiente di ripiegamento e dalle caratteristiche del prodotto, quindi potrebbe non fornire il massimo livello di espressione o la migliore qualità del prodotto.
Una linea di valle più breve è preziosa solo se la proteina secreta è sufficientemente stabile, attiva e concentrata per un recupero economico.
L'espressione intracellulare può aumentare il titolo ma aumenta la complessità del recupero
L'espressione intracellulare può produrre quantità sostanziali di proteina ricombinante, ma il prodotto deve essere rilasciato dalla cellula e separato da un lisato complesso. Le fasi aggiuntive di lisi e chiarificazione aumentano la richiesta di apparecchiature, il tempo di elaborazione e le opportunità di degradazione.
Il processo può diventare sostanzialmente più complesso quando la proteina forma corpi di inclusione e richiede il ripiegamento.
"Secreto" non significa "purificato"
Le proteine extracellulari condividono ancora il terreno con proteine della cellula ospite, acidi nucleici, metaboliti, componenti del terreno e potenzialmente proteasi. La chiarificazione rimuove cellule e detriti grandi, ma non fornisce un prodotto purificato.
Le operazioni di cattura e rifinitura rimangono necessarie e la loro selezione dovrebbe riflettere carica proteica, affinità, dimensioni, stabilità e profilo delle impurità.
Metodi di rilascio aggressivi possono compromettere la qualità
La lisi cellulare completa può massimizzare il rilascio del prodotto, ma rilascia anche contaminanti e può esporre la proteina a proteasi o condizioni dannose. Il rilascio periplasmatico selettivo può ridurre questo carico, ma può fornire un recupero incompleto o richiedere un ulteriore sviluppo del processo.
L'operazione unitaria migliore è quindi quella che bilancia l'efficienza di rilascio con l'attività del prodotto e la separabilità a valle.
Fare la scelta giusta per il tuo obiettivo
Il meccanismo di secrezione dovrebbe essere trattato come una variabile di progettazione del processo iniziale, non come un dettaglio minore dell'espressione.
- Se il tuo obiettivo principale è una linea di valle breve e semplice: Prediligi un ospite e una strategia di espressione che fornisca la proteina extracellulamente, quindi progetta la chiarificazione attorno alla centrifugazione o alla microfiltrazione a flusso tangenziale.
- Se il tuo obiettivo principale è massimizzare il recupero da un prodotto intracellulare: Fornisci capacità sufficiente per la raccolta della biomassa, la rottura ad alta pressione, la chiarificazione del lisato, l'ultrafiltrazione e la cromatografia.
- Se il tuo obiettivo principale è un prodotto periplasmatico in batteri Gram-negativi: Valuta il rilascio selettivo e confronta la sua resa e il profilo delle impurità con la lisi cellulare completa prima di fissare la linea di recupero.
- Se il tuo obiettivo principale è un prodotto in corpi di inclusione: Includi operazioni dedicate di separazione dei corpi di inclusione, denaturazione, solubilizzazione e ripiegamento controllato nella progettazione dell'impianto pilota.
- Se il tuo obiettivo principale è preservare l'attività proteica: Riduci al minimo lo stress meccanico, chimico e termico non necessario e utilizza il pI e il profilo di stabilità della proteina per impostare le condizioni di precipitazione e cromatografia.
Comprendere dove risiede la proteina al momento del raccolto è la base per selezionare un processo a valle che sia scalabile, economico e in grado di preservare la qualità del prodotto.
Tabella riassuntiva:
| Posizione della proteina al raccolto | Prime operazioni unitarie tipiche | Principali considerazioni di progettazione |
|---|---|---|
| Extracellulare | Centrifugazione o microfiltrazione, ultrafiltrazione, cromatografia | Prodotto diluito, fouling della membrana, stabilità del prodotto, rimozione delle impurità |
| Periplasmatica | Rilascio selettivo, chiarificazione, ultrafiltrazione, cromatografia | Efficienza di rilascio, impurità dell'involucro cellulare, compatibilità del prodotto |
| Citoplasmatica | Raccolta della biomassa, omogeneizzazione ad alta pressione, chiarificazione del lisato | Viscosità, carico di solidi, generazione di calore, rimozione dei detriti |
| Corpi di inclusione | Rottura cellulare, recupero dei corpi di inclusione, solubilizzazione, ripiegamento, purificazione | Controllo del denaturante, miscelazione, tempo di residenza, recupero della proteina attiva |
| Extracellulare eucariotica | Chiarificazione cellulare, concentrazione, cattura, rifinitura | Proteine della cellula ospite, DNA, proteasi, stabilità del prodotto |
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